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蛋白表達是什么?

更新時間:2021-10-13點擊次數(shù):1044
  大腸桿菌是目前應(yīng)用廣泛的蛋白表達系統(tǒng),其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達系統(tǒng),表達的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。本實驗中,攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中,在37℃,IPTG誘導(dǎo)下,超量表達攜帶有6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質(zhì)加以提純,實為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電冰進行分析。
  蛋白表達操作步驟:
  一、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)
  1.接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL.21菌株于5mL.LB液體培養(yǎng)基中(含100ug/ml氨芐青霉素),37C震蕩培養(yǎng)過夜。
  2.轉(zhuǎn)接lml過夜培養(yǎng)物于100mL(含100ug/l.氨芐青霉素)LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至0D600=0.6-0.8。取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。
  3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/1,37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h.
  4.12,000rpm離心10min,棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
  二、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離,純化
  1.NTA層析柱的準(zhǔn)備:在層析柱中加入1ml.NTA介質(zhì),并分別用8l去離子水,8mL.上樣緩沖液洗滌。
  2.重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5ml.上樣緩沖液,用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min,4℃12000rpm離心30min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取10u1上清樣品用于SDS-PAGE分析。
  3.上清樣品以10-15ml./h流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。
  4.洗脫雜蛋白:用Washing Buffer以10-15ml./h流速洗柱,直至0D280=0.01.分步收集洗脫液,約3-4h,取10ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE分析。
  5.洗脫目標(biāo)蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1l.級分,分別取10u1樣品用于SDS-PAGE分析。
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